Catalog

8 Akademi 10 Mayıs 2017 Çarşamba Nasıl ölçülür: DNA diziliminiz Tunç Kayıkçıoğlu Deoksiribonükleik asidin kısaltması olan DNA, ilk kez Friedrich Mischer tarafından 1869’da hücre çekirdeğinde bulunan mikroskobik parçacıklarda keşfedildi. 1878’de DNA’yı bağlı proteinlerden ayırmayı başaran Albrech Kossel, yapı taşlarında adenin (A), timin (T), sitozin (C) ve guanin (G) gibi farklı organik bazların varlığını gözlemledi ve 1919’da Phoebus Levene de bu bazların günümüzde nükleotit denilen baz, şeker ve fosfattan oluşan yapı taşları olduğunu ortaya koydu. 1950’ler Avusturyalı kimyager Erwin Chargaff’ın eşit miktarda AT ve eşit miktarda GC nükleotitleri bulunduğunu ölçmesine ve WatsonCrick’in çift sarmallı modeli geliştirmesine tanık oldu. DNA’nın ana kalıtım materyali olduğu yine 1950’lerde birçok deneyle kanıtlanmış olsa da bu AT ve GC çiftlerinin tam dizilimini okumanın bir yolu yoktu. Bugün geriye bakınca, bir yolu olsaydı bile muhtemelen gerekli hesaplama teknolojisi var olmadığı için o yolun iş görmeyeceğini söylemek mümkün. Çünkü verilerin moleküler boyutları küçük ve adedi oldukça büyük. İnsan genomu yaklaşık 3 milyar nükleotide sahip ve ardışık iki baz arasındaki uzaklık da 0.3 nm civarında. Yani ayırt edilmesi gereken bilgi paketleri birbirine görünür ışığın dalga boyunun binde biri kadar yakın. Şu ansa insan ve diğer birçok canlının neredeyse tüm DNA sekansına sahibiz. Hatta bu bilgi size de bir tık uzaklıkta: http://ncbi.nlm.nih.gov/ genome/. Peki bu değerli veri setini na lsıl elde edebildik? Polimeraz zincir reaksiyonu: Fazla, daha fazla, çok daha fazla Öncelikle var olan sınırlı miktardaki DNA’yı kopyalayarak çoğaltma teknolojisini anlamamız gerekiyor. Biraz daha belirgin olan birinci sebep kaynak sayısı arttıkça sinyal kalitesinin hızla artması. Günlük hayatla bağlantı kuralım: Gün ortasında Konak Meydanı’nda bağıran tek bir kişinin söylediklerini anlamak gürültü sebebiyle imkânsızdır. Oysa bir toplumsal gösteri sırasında aynı sloganı atan bir grup gürültüyü kolaylıkla bastırarak sesini duyurabilir. Di zilenecek DNA’nın mümkün olduğunca saf ve çok örneğinin üretilebilmesi de benzer bir sebepten ötürü tipik bir gereklilik. Diğer sebep ise “üretirken dizileme” denilen yaygın kullanılan yöntemlerin, bu teknolojinin çeşitlemeleri olmaları. Ortalama bir insanın 70 kg, hücrenin de 10 µm boyutunda bir küp olduğunu kabul edersek, her biri tek bir zigot genomundan çoğaltılmış trilyonlarca kopyayla yaşadığımızı fark edebiliriz. Yani aslında aradığımız çoğaltma sistemi doğada zaten mevcut: DNA polimeraz. Dayanıklılık sebebiyle çok yüksek sıcaklıklarda yaşamaya uyum sağlamış canlıların enzimleri tercih sebebi ve gerekli şartlar sağlandığında deney tüpünde de çalışabiliyor. Örneğin vücut sıcaklığında (370C) maksimum aktivite gösteren tipik enzimlerin aksine, kaplıcalarda yaşayan Thermus aquaticus bakterilerinde bulunmuş Taq polimerazın optimum çalışma sıcaklığı 75800C civarında. Biyoteknoloji şirketleri, düşük hata ve yüksek verimle çalışması için bazı ufak değişiklikler yaptıkları bu polimerazları bakterilerden düşük maliyetle elde edebiliyor. Şekil 1, polimeraz zincir reaksiyon, yani İngilizcesiyle Polymerase Chain Reaction’ın baş harfleriyle anılan, PCR tekniğini özetliyor. Öncelikle çoğaltılacak taslak DNA ve eklenmeye hazır nükleotitlerin yanı sıra, kimyasal olarak sentezlenmiş küçük DNA parçaları da (primer) içeren bir karışım hazırlamak gerekiyor. Çünkü DNA polimeraz yeni bir DNA ipliği üretemeyip sadece var olan iplikleri uzatabiliyor. Yarı korunumlu DNA replikasyonu sırasında DNA’nın iki ipliğini birbirinden ayırmak için gerekli hücredeki enzimatik sistem yerine de sıcaklığı arttırmak gerekiyor (1). Daha sonra ise sıcaklık yüksek derişimdeki DNA parçacıklarının taslağa bağlanabildiği ama diğer rastlantısal yapışmaların mümkün olmadığı bir sıcaklığa düşürülüyor (2). Son ola rak da karışım polimeraz aktivitesinin yüksek olduğu bir sıcaklıkta birkaç dakika bekletilerek her bir iplik, tekrar çift ipliğe tamamlanıyor (3). Her döngünün başlangıcında kullanılan DNA’dan iki adet üretildiğinden, DNA molekülü sayısının 1, 2, 4, 8, 16, 32 şeklinde geometrik olarak arttığını gözlemleyebiliriz ve bu başlangıçta var olan DNA başına 30 döngüden sonra yaklaşık 1 milyar DNA elde edileceği anlamına geliyor. Tabii pratikte bu sistem, reaksiyon karışımındaki nükleotitler ve primerler tükenmeye başladıktan sonra doyuma ulaşıyor. Mutfak robotu büyüklüğündeki programlanabilir sistemler sayesinde bu işlem oldukça hızlı ve kolay. Bu sebeple de modern biyoteknoloji laboratuvarlarında çok sık kullanılıyor. Nitekim PCR çalışmaları, Kary Mullis’in 1993 Nobel Kimya Ödülü’nü almasını sağladı. l Sanger dizilemesi PCR tekniğinde kullanılan nükleotitler hücrelerin kullandığının aynısı. Sonunda elde edilen ürün de biyolojik DNA’nın aynısı. Ama deneysel amaçlarla yapay nükleotitler kullanarak değişik DNA türevleri de elde edebiliriz. Çünkü diğer pek çok enzim gibi, DNA polimeraz da hedef moleküllere karşı seçici olmakla birlikte benzer moleküllere de belli bir toleransı var. Hatta protein mühendisliğiyle istenilen yapay moleküllere de tolerans sağlanabiliyor. Yukarıda özetlenen PCR’de amacımız taslak DNA’nın mümkün olduğunca kusursuz bir kopyasını elde etmekti. Dolayısıyla da yeni ipliklerin uzayabildiği kadar uzamasına izin vermiştik. Fakat ardışık nükleotitler arasında bağ kurulması için gerekli fonksiyonel grupları değiştirerek yeni nükleotitlerin eklenmesini engelleyebilir, böylece uzama aşamasını erken sonlandırabiliriz. Bu anormal nükleotitlere yeni işaret grupları da bağlarsak bazları ayırt edilebilir hale getirebiliriz. Şekil 1 ?KİMDİR Tunç Kayıkçıoğlu, Boğaziçi Üniversitesi mezunu. ABD’de Johns Hopkins Üniversitesi’nde biyofizik üzerine doktora yapıyor. Bu değiştirilmiş nükleotitlerden PCR karışımına çok az miktarda eklersek, uzama aşamasında zaman zaman uzatılamayan türevler konarak uzama kesilir. Durma noktasının yeri de tamamen rastlantısal olacağından, reaksiyonun son ürünü her biri farklı uzunlukta olan DNA parçacıkları olur. Sentez sürecinden sonra yapılması gereken, bu DNA karışımını uzunluğuna göre sıralamak. Molekülleri büyüklüklerine göre ayırmak için DNA karışımını bir jelin bir ucuna koyuyor ve öteki ucuna doğru elektrik akımı kullanarak çekmeye çalışıyoruz. Küçük moleküller jele daha az takıldığından öbür kutba daha hızlı ulaşıyorlar. Bunu boyut farkından dolayı eşyalarla dolu bir tavan arasında yetişkinlere göre hedefe daha rahat ulaşabilen çocuklara benzetebiliriz. Analiz basamağında yapmamız gereken tek şey kısadan uzuna sıralanmış moleküllerin sinyallerine bakarak son bazın hangi baz olduğunu çıkarmak ki bu basit süreç Şekil 2’de gösteriliyor. Ana çalışmada etiketlemek amacıyla radyoaktif fosfor kullanılmıştı fakat endüstriyel olarak daha çok benimsenen sistem floresans moleküllere dayalı. Modern sistemlerde radyoaktif jel filmi çekmek yerine de floresans boyalı DNA parçacıklarının lazer ve detektör önünden geçmeleri için gereken süre kullanılıyor. Boyutsal ayırma için de örnek içi jel ile dolu ince bir tüpten geçiriliyor. Frederick Sanger ve ekibi tarafından 1970’lerde geliştirilen bu yöntemin veri sağlama potansiyeli kısa zamanda bilim çevrelerince fark edildi. Öyle ki 1980 Nobel Kimya Ödülü’nü paylaşmaya layık görüldü. l Uzun ince bir yol Tüm genomu okumak için yapılması gereken iş her ne kadar ardışık floresan sinyallerini bu şekilde toplaya toplaya her bir kromozomu baştan başa kat etmek gibi görünse de durum biraz daha karmaşık. Çünkü bu sistemin kabul edilebilir bir hata oranı ile okuyabildiği >>