Catalog

31 Mayıs 2017 Çarşamba Akademi 7 >> Üstelik her üretmek istediğimiz protein için bütün bu süreci baştan tekrarlamak da çoğu zaman gerekmiyor. Çevresel etkilere karşı dayanıklılığı sayesinde postayla laboratuvarlar arası örnek alışverişi yapmak mümkün. Birçok laboratuvarın katılımıyla oluşturulmuş DNA kütüphanesine sahip Addgene organizasyonu, 50 bin civarında değişik plazmidi araştırmacıların kullanımına sunuyor. Proje bütçelerinin kolaylıkla kaldırabileceği bir ücret karşılığında talep edilen plazmitleri üretip postalayan şirketler de mevcut. Rekombinant DNA tasarımında protein üretimi amacıyla kullanılacak organizmanın da göz önünde bulundurulması gerekli. Teknik bir sebep aksini gerektirmedikçe sindirim sisteminizde de yaşayan Escherichia coli bakterileri tercih ediliyor. Bunun nedeni hayvanların yoğun bakım gereksinimi yanında bu bakterilerin çok daha hızlı, ekonomik ve zahmetsiz olmaları. İçerisinde biraz karbonhidrat, parçalanmış protein ve tuz içeren bir besin çözeltisini vücut sıcaklığında tutmak ve karışımı hava alabilmesi için birkaç saat çalkalamak yeterli. Gelişmiş hücrelere özgü biyokimyasal reaksiyonlar gerektiren üretimler için kullanılan diğer bir popüler model canlı ise bira mayası. Şekil 4 Şekil 4’te de anlatıldığı gibi, önce üzerinde yapay seçilim amacıyla kullanılabilecek özellikler barındıran bir genetik yapı seçiliyor. Bakteriler için bu amaçla çoğunlukla antibiyotik direnç geni içeren plazmitler kullanılıyor. Bu plazmidi kazanan bakteriler antibiyotikli ortamda hayatlarını sürdürebiliyorlar (sol). Kesilmiş plazmitler enzimlerin sindirimine maruzken (orta) transfer edilecek yeni geni içeren DNA parçalarıyla tekrar kapanan rekombinant plazmitlere sahip hücreler de antibiyotik baskısına dayanabiliyor (sağ). Bu sayede yeni DNA segmentinin başarıyla aktarılabildiği hücreler diğerlerinden ayrılabiliyor. Mikroorganizmalara yeni kalıtsal özelliklerin kazandırıldığı bu sürece transformasyon deniyor. l Protein üretimi İnsan proteini üretecek DNA’yı bir plazmide koyduk. O zaman nasıl oldu da bu plazmidi insan hücresine koymadan bakteri veya bira mayasından elde edebileceğiz? Bu sorunun cevabı evrimde saklı. Buzdolabınızdaki bira mayası her ne kadar aynadaki görüntümüze benzemese de aslında aynı atadan geliyoruz. Genlerinizin dörtte biri de ortak. Bakterilerle akrabalığımız biraz daha uzak da olsa yine de temel biyokimyasal benzerliklere sahibiz. Bunlardan biri de genetik kod: Bazı istisnalar dışında aynı DNA parçası tüm canlı hücrelerin dilinde aynı proteinin üretilmesi gerektiği anlamına geliyor. Tablo 2, genomun protein kodlayan bölümlerinin protein üretim mekanizması tarafından nasıl yorumlandığını gösteriyor. 20 temel aminoasitten hangisinin konacağı DNA’daki nükleotit üçlemeleriyle kayıt altında tutuluyor. Protein üretiminin durdurulması gerektiği mesajı da yine üç adet üçlemenin biriyle iletiliyor (STOP). Yukarıda alıntılanan DNA parçası, protein kodlayan bir bölümden olsaydı, beklenen protein dizilimi E F E L G T R G S S R V D olacaktı. Harf Amino kodu asit DNA kodu A Alanin GCT, GCC, GCA, GCG C Sistein TGT, TGC D Aspartik asit GAT, GAC E Glutamik asit GAA, GAG F Fenilalanin TTT, TTC G Glisin GGT, GGC, GGA, GGG H Histidin CAT, CAC I Izolösin ATT, ATC, ATA K Lizin AAA, AAG L Lösin TTA, TTG, CTT, CTC, CTA, CTG M Metiyonin ATG N Asparagin AAT, AAC P Prolin CCT, CCC, CCA, CCG Q Glutamin CAA, CAG R Arginin CGT, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG S Serin TCT, TCC, TCA, TCG, AGT, AGC T Treonin ACT, ACC, ACA, ACG V Valin GTT, GTC, GTA, GTG W Triptofan TGG Y Tirozin TAT, TAC STOP Dur TAA, TGA, TAG Tablo 2: Aminoasitler ve DNA’daki karşılıkları Ne yapılması gerektiğini bulduktan sonra aslında bu prosedür mutfağımızdakinden çok daha karmaşık bir ekipman içermiyor. Yine de köşe başında bir laboratuvar açıp üretime geçmeniz pek kolay değil, zira küresel biyokimyailaç sektörü bu teknolojinin kâr potansiyelini erken fark edip yatırım yapmış. Tıbbi kullanımı onaylanmış ilk rekombinant teknoloji ürünü humulin: Human insulin, yani insan insülini. Pankreastan salgılanan bu Şekil 5 hormon, kan şekerinin kontrol altında tutulmasını sağlıyor. Dünya Sağlık Örgütü’ne göre dünyadaki 400 milyon şeker hastasının her gün kullanmak zorunda olduğu insülin patentlerinin aslan payı Danimarkalı Novo Nordisk ve Fransız Sanofi şirketlerinin elinde. Humulin için ilk patent başvurusu 1979’da şimdi Roche’un bünyesindeki ABD’li Genentech şirketince yapılmış (US4704362A). Aradan geçen süre zarfında hormonun etkinliğini arttıran bazı ufak değişiklikler içeren birçok varyasyonu da ayrı ayrı patentlenmiş olsa dahi üretim tekniğinin ana hatları ilk patentteki çizimden alıntılanmış Şekil 5’te anlatıldığı gibi. pBB101, üzerinde tetrasiklin ve ampisilin direnci sağlayan 2 gen bulunduran ana parça. Buna eklenmiş ?plac5’in üzerindeki ßgal ile ifade edilen ise laktoz (süt şekeri) parçalamaya yarayan bir enzimi kodlayan gen. Fakat durma sinyalini içeren parça silinmiş olduğundan, protein üretimi bir kez ßgal üretmeye başladığında duramayıp ucuna pBH1 parçacığı aracılığıyla konulmuş olan insülini de ekliyor. Bu iki proteini birbirinden daha sonra bir kimyasal tepkime ile koparıyorlar. ßgal sadece ortamda parçalayacak şeker varsa üretiliyor, bu yüzden de protein üretimini tetiklemek için besi ortamına moleküler yapısı laktoza benzeyen isopropylthioßD galactoside adında bir kimyasal ekleniyor. Yani bakteri iki açıdan kandırılmış oluyor: Tüketilebilecek şeker olduğu izlenimi verip kendi sindirim enzimi sandığı mühendislik ürünü başka bir proteini ürettiriyoruz. Büyüme hormonu, kan yapıcılar, aşılar ve hatta antikorların kendisi memeli serumundan çıkarılmak yerine bu teknolojiyle üretilebilen ticari ürünler. Ayrıca yepyeni proteinler tasarlamak veya tamamen farklı proteinlere eklemeler yaparak mevcut proteinlere yeni yetiler kazandırmak da mümkün. Buna örnek olarak ateşböceğinin ışık saçmasını sağlayan tepkimeyi gerçekleştiren enzimi bir proteine bağlayarak tespit edilebilir hale getirmeyi örnek verebiliriz. Hedef proteinlerin kromatografi ile saflaştırılmasında çok sık kullanılan bir yöntem de küçük protein eklentiler taktıktan sonra bu eklentilerin yapışacağı bir materyalden geçirmek. Rekombinant DNA teknolojisi sadece araştırma veya ilaç sektörüyle sınırlı da değil. Enzimlerin büyük bir bölümü proteinlerden oluşuyor ve gerçekleştirdikleri tepkimeler sanayi ürünlerinde kullanılabiliyor. Rekombinant enzim ile mikroorganizma üretimine odaklanmış Danimarkalı Novozymes şirketi, küresel endüstriyel enzim marketinin yarısını elinde bulundurduğunu iddia ediyor. Enzimlerin deterjandan hayvan yemine, kumaş boyamadan peynir mayalamaya uzanan geniş bir uygulama alanına sahip olduğu günümüzde, firmanın 2016 cirosu 2 milyar Avro. Yani diğer birçok yüksek katma değerli ürün gibi rekombinant ürünler de yükte (birkaç miligram kadar) hafif ama pahada epey ağır. n